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Nature:抗体的大问题

很多生物医学实验的进行都依赖于抗体。因此很多实验的上限便取决于抗体的质量。烂抗体会导致错误的结果和结论,甚至最终毁掉一个项目。

2006年对耶鲁大学的病理学家David Rimm而言一切都显得非常愉悦。他研发出一个用于评价皮肤黑素瘤治疗效果的活体组织检验方法。该方法依赖于一个大的Y型抗体结合到特定的生物分子来标记其在样本上的结构。Rimm发现抗体能结合到肿瘤的活检组织上,产生一个特定结构,可用于评价该病人在手术后是否需要接受严格的药物治疗。他投入了两百万美元的经费用于该检验方法的建立和推进。

 
然而2009年,情况急转直下。Rimm订购了一批新的抗体,但是他的团队难以重复出原来的结果。抗体是购于同一个公司的,相同货号,不同批次,但是他们不能在相同位置的定位到特定的结构,甚至不能在相同的肿瘤上染色。Rimm被迫放弃他在黑素瘤抗体检验上的项目开发。他说:"这是一个教训,我们本不应如此依赖抗体。这是一个令人沮丧的会议。"
 
抗体是生物科学领域一种常用工具,可用于识别和分离其他分子。但是,抗体也被认为是研究中产生问题的常见诱因。Rimm经历的这种抗体批次间差异导致戏剧化的结果的不同。更为严重的是,抗体常常能识别除目的蛋白外的其他蛋白,这可能导致项目的失败,时间、金钱以及样品的大量浪费。
 
许多人认为抗体是目前实验中遇到"重复性危机"的主要原因,人们逐渐认识到生物医学实验的结果难以重复,而基于这些实验的结论尚待进一步确认。来自宾州TetraLogic Pharmaceuticals的首席科学家 Glenn Begley在他备受争议的一篇分析性文章中指出特异性不好的抗体比实验中的其他工具更容易出现问题,53份肿瘤研究标志性论文中有47份的结果难以重复。
 
如今,有少部分因抗体而焦头烂额的科学家将这个问题提了出来。因抗体问题而备受挫败的Rimm开始了他的"圣战",撰写相关的综述,召开网络研讨会,在无数的会议讨论上提出这个问题。这些科学家呼吁建立一套抗体生产、使用和描述其性状的标准。与此同时,有许多用于衡量抗体质量的基层研究工作如雨后春笋般涌现。
 
但是时间太短了,尚不能形成真正的改革。"虽然有如此多的资源,但没有人用它们,甚至很多人尚不知道这些资源",一个位于华盛顿的非盈利机构,全球生物标准机构(Global Biological Standard Institute)首脑Len Freedman说,"许多抗体供应商并不想改变现状,即使有些抗体非常差。"
 
买家注意 
 
加拿大Mount Sinai医院蛋白质组学研究员loannis Prassas与他的同事致力于一个叫CUZD1的蛋白的研究,他们认为该蛋白可用于表征胰腺癌的患病与否。他们买了蛋白检测试剂盒,花费两年时间,50万美金,数以千计的病人样本才发现这个抗体识别另一个肿瘤蛋白,CA125,而非识别CUZD1。Prassas回忆说他和他的团队当时急于求证一个有前景的假设,导致大家都没有去做抗体验证的实验。如果有人说"你可以用这个检测",你会急于去做检测而忘记保证有效的并非是你的这种情况。
 
大多数科学家相信抗体管子标签上的文字,Rimm开玩笑说:"作为一个病理学家,我未被训练验证这些抗体,只知道订购它们。"
 
 
抗体是大多数脊椎动物的免疫系统针对入侵者如细菌产生的。自1970年以来,科学家们为研究开发了大量抗体。研究人员将感兴趣的蛋白注射到兔子体内,白细胞中的B细胞开始产生抗这种蛋白的抗体,收集这只兔子的血液就可以得到抗体。为了得到一致性更高的产品,可以将B细胞回收,与一个"永生的"细胞(骨髓瘤细胞)融合,在体外培养,从理论上讲,可以得到源源不断的抗体供应。
30年前,科学家需要自己提取抗体用于研究,从90年代末期开始,试剂公司开始接手这项业务。
如今,有超过300家公司在销售种类超过200万的抗体用于研究。根据全球咨询机构Frost&Sullivan的报告,2011年,抗体市场总值达到16亿美金。
 
毁灭性的影响 
 
有迹象表明,抗体问题对研究纪录有广泛和潜在的毁灭性影响。2009年,一个杂志致力于评估用于研究G蛋白偶联受体(GPCRs)的抗体质量。G蛋白偶联受体是一种细胞信号蛋白,它是各种疾病如大小便失禁,精神分裂症药物的靶向蛋白。这19个靶向信号受体的49个商品化抗体分析后发现,大多数可以结合多个蛋白,这说明它们不能用于特异性的识别目的受体。
 
表观遗传学是一门对抗体依赖性非常高的学科,它需要抗体来识别蛋白如何调控基因的表达。2011年,一个评估报告指出用于表观遗传学研究的246个抗体中,有1/4的面临抗体特异性的质疑,这表明,它们常常结合到其他蛋白上。其中有4个抗体具有很高的特异性,但不是在正确的靶蛋白。
 
有趣的是,科学家们知道在其研究领域有些抗体是不可信的,但就整个生物领域而言来评估这个问题的是非常困难的。也许目前最大的评估来自瑞典财团Human Protein Atlas出版社,它致力于收编人类基因组每个蛋白的抗体。其随后发现近20000种商业化的抗体中,不到50%的抗体可以与组织切片有效结合。这引发一些科学家提出超过一半的商品化抗体不可信。
 
但是可信性与实验密切相关。与Human Protein Atlas合作,来自斯德哥尔摩皇家理工学院的Mathias Uhlén说:"我们发现商品化的抗体一般可以使用,但在别人的实验中,可能不起作用。"
 
研究人员应该检查一个抗体在特定的应用和组织类型中经过测试,但是供应商提供的产品信息质量差异极大。科研人员常抱怨试剂公司不提供抗体特异性的数据或者是批次间差异性数据。公司可能提供一批抗体但是给你前一批抗体的信息。而这些数据往往是在理想情况下得出而不能反映典型的实验条件。抗体公司解释说,将它们的产品在每一种实验条件下做检测时不可能的,但是它们提供的数据是可信的,它们将与科研人员一起提高抗体质量和性能。
 
"许多学者用Google来寻找产品,所以对于有些公司来说优化搜索结果比优化产品更加重要",英国生物技术咨询公司Pivotal Scientific(总部Frost&Sullivan位于华盛顿)首席 Tim Bernard说,"研究人员往往更关心几天能拿到抗体,而非寻找合适的抗体,这是'亚马逊效应',他们希望2-3天收货,且免邮。"
 
意识到抗体问题的研究人员说科学家需要更加警惕,"抗体不是魔法药水,你不能把它们加到你的样品上,然后期待所得的结果100%可信而不进行严谨的思考",制作神经科学相关抗体,来自加州大学戴维斯分校NeuroMab首席James Trimmer说。与很多供应商一样,NeuroMab明确指出抗体可以应用的实验类型,但是科研人员并不总是遵照执行。
 
理想情况下,科研人员会拒绝购买没有广泛验证数据的抗体,或者会自行验证抗体效价(见"Bad antibodies")。这是Rimm目前致力于推广的,他向每一个感兴趣的人介绍新开发的一个抗体效价评估的多步骤流程。但是这个流程非常耗时,例如,Rimm建议设立对照试验,利用细胞工程建立表达和不表达目的蛋白的细胞系。他甚至承认几乎没有实验室会进行该评估流程的所有步骤。
 
有些科研人员从不同的供货商买半打抗体,然后进行预实验,筛选起作用的抗体。但他们可能只是从不同的地方买了相同的抗体。大的试剂供应商在目录上竞争激烈,所以他们会从小供货商购买抗体,重新标签售卖。Bernard说市场上200万的抗体可能只有25万-50万特异的"核心"抗体。
 
因为某些原因,研究人员相信经人口述或已发表的文献。但这引发了一个自我延续的问题,后续开发的具有更好效价的抗体几乎不被采用,University of Oslo的一位蛋白组学研究员Fridtjof Lund-Johansen说,"我们在市场上有很好的抗体","但我们不知道哪些是",Lund-Johansen正在研发一个高通量的检测,可以一次性检验上千种抗体的效价。
 
测试时间 
 
在过去十年间,各种项目如雨后春笋般涌现,致力于提供更便捷的抗体搜索信息。由Human Protein Atlas设立的在线门户网站Antibodypedia(Antibodypedia.com)记录了超过180万抗体,提供它们在不同实验上的检测数据。另一个在线门户网站Antibodies-online(Antibodies-online.com)自两年前启动了一个委托独立实验室检测抗体的项目,大多数由供货商提供资金。但在这275项研究中,不到一半抗体达到标准,并得到"独立检测"的认可。非盈利组织Antibody Registry(antibodyregistry.org)分配唯一的标识符给抗体,然后将其指向其他资源。另一个项目,pAbmAbs(pabmabs.com/wordpress),以类似社会推荐的服务网页Yelp的方式运营,鼓励人们提供抗体的评论文字。
 
但这些努力在科学界尚未找到立足点,许多在本文提及的科学家甚至不知道这些资源的额存在。
 
抗体不是魔法试剂 
 
抗体市场已经非常拥挤,这导致一些供应商将良好的质量信誉作为商业计划的一部分。Bernard说:"现在竞争如此激烈,我们必须进行产品差异化。"如英国剑桥的Abcam公司,鼓励抗体使用者在其公司网站上报告他们自己的使用数据。Abcam公司对购买行为的分析表明顾客在购买抗体前平均进行9次数据页面的查看,这说明顾客需要更多的数据。
 
总部设在加州圣地亚哥的抗体公司Abgent,联合其中国上海的子公司无锡药明康德大约在一年前启动了抗体检测计划。审查后,它删减了目录上1/3的抗体产品。至于这是否是一个明智的决定取决于顾客是否愿意花更多的钱来买更好的产品,公司的区域领导John Mountzouns说,但目前,顾客的投诉率已经大幅下降。
 
一些科学家呼吁更为激进的改变。在2月份Nature的一篇评论文章中,来自New Mexico, Los Alamos国家实验室的Andrew Bradbury和其他100多位联名作者提出了一个颠覆性的方法用于抗体生产和销售。他们建议只使用已经定义到DNA序列水平的抗体,并通过组织工程的重组细胞的方式来生产抗体。这可以大大降低来自抗体生产动物产生的差异性。但是这个提案需要用到许多公司认为是商业机密的特定抗体信息。这将导致抗体市场和上百万产品的拆除重建。
 
Uhlén,这篇评论文章的联名作者,认为这个计划是一个遥远的希望。他认为Bradbury所期待的"重组抗体",比起传统方法将需高10-100倍的投入,而不能保证抗体效价比传统方法更好。"在最后,抗体结合效价才更重要",他说,"有明确的序列并不能说明它能产生作用。"为了找到更加廉价,快速,可信的抗体生产方式,也有其他项目正在进行,如不使用免疫动物,仅在病毒上表达和优化抗体蛋白序列。
 
描述现今可用抗体的局势刻不容缓。抗体是提高实验的可重复性的重要组成,有研究人员提出在一个独立的机构,建立一个商业抗体认证计划。同时许多期刊(如Nature)需要作者提供文章中所用抗体应用于特定实验的检测依据。
 
抗体质量会缓慢提高,而非飞跃,Trimmer说,他希望形成一个良性的反馈机制:当科研人员见到一些假象时,他们会进一步验证结果,从而发现更多假象。他说,如今广泛的不被重视的抗体检测逐渐消失,"事情开始出现转变",他说,"我们需要一直研讨这个话题。"
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